2010. február

Kovács Mihály az ELTE Biokémiai Tanszékének tudományos főmunkatársa. Posztdoktorként az amerikai Nemzeti Egészségügyi Intézetekben töltött három évet; hazatérve megalakította a Motorenzimológiai Kutatócsoportot. 2008-ban - tíz évvel a biológus diploma megszerzése után - habilitált, 2009-ben Talentum-díjjal tüntették ki, és „A genomintegritás megőrzésének molekuláris mechanizmusai” c. pályázatával a Norvég Alap és az OTKA „Nemzetközi ismertséggel rendelkező fiatal kutatók tudományos életpályájának elősegítése” című pályázatának egyik nyertese lett.

A Biokémiai Tanszéken „nevelkedtem” - meséli -, diákkoromban a motorfehérje-kutató csoportban dolgoztam, első mentoraim Nyitray László, Málnási-Csizmadia András és Hegyi György voltak. A csoport tudományos öröksége Szent-Györgyi Albert és társai munkásságára vezethető vissza, akik Szegeden az 1940-es évek elején átütő eredményeket értek el az aktomiozin-kutatásban - az izom-összehúzódásban szerepet játszó fehérjék tanulmányozásában. A háború után Szent-Györgyi professzor és csoportjának nagy része Budapestre költözött, s végül - áttételek után - az ELTE Biokémiai Tanszékén folytatódtak a vizsgálatok.

Az izomfehérjéken kívül ma már nagy sok „nem-izom” mozgatófehérjén is dolgozunk; a motorfehérje-kutatás jelentős része sejtváz-fehérjéken és más, citoplazmatikus mozgatórendszereken zajlik - olyan rendszereken, amelyek minden eukarióta (valódi sejtmaggal rendelkező) sejtben jelen vannak, és a sejtmozgást, a sejtszaporodást, a különböző speciális sejtalkotók kialakulását, szállítását vizsgálják.

Két évvel ezelőtt gondolkodtam el azon, hogy az aktomiozin motorfehérje-kutatásban megszerzett tudással visszakanyarodhatnék egy másik régi szerelmemhez, a genetikához, a biológiai információtárolás, -továbbítás, -feldolgozás mechanizmusának a vizsgálatához. Így találtam rá a DNS-helikázokra. Ezek mechanikai szempontból motorenzimeknek tekinthetők, mert az aktomiozinhoz hasonlóan az ATP (adenozin-trifoszfát) elbontásából (hidrolíziséből) származó kémiai energiát használják fel arra, hogy mechanikai munkát végezzenek. A DNS-helikázok azon enzimek közé tartoznak, amelyek „a genetikát csinálják”: a génműködéshez szükség van a DNS-nek, ennek a nagyon hosszú „madzagnak” a pontos és finom mechanikai manipulálására. Ez a magas szinten szabályozott, bonyolult aktivitás az egyedi molekuláris események szintjén „húzás-nyúzás”. Gondoljunk például arra, hogy amikor lemásolódnak a DNS szálai, vagy amikor hibajavításra kerül sor, akkor a két szálnak szét kell válnia. Önmagától ez nem történik meg, csak akkor, ha egy enzim beavatkozik. Ehhez energiára van szükség, amit az ATP hidrolízise szolgáltat.

A DNS-helikázok közül a RecQ családot szemeltem ki. Ezekkel az enzimekkel azért kezdtem el dolgozni, mert a RecQ enzimek központi szerepet játszanak a hibajavító mechanizmusokban. A biológiai információfeldolgozás egyik fontos mozzanata a hibajavítás. Egyrészt tudjuk, hogy fizikai és kémiai ágensek legtöbbször azért rákkeltőek, mert a DNS-ben változást okoznak. Vagy közvetlenül, kémiailag módosítják a DNS-molekula szerkezetét, vagy a másolás pontosságát rontják, és ezzel is sokszor nemkívánatos mutációkat - örökletes megváltozásokat - okoznak a DNS-ben. De a kémiai, fizikai faktorokon kívül a természetes információfeldolgozó rendszer is produkál hibákat. Egyrészt a DNS-t másoló gépezet, másrészt az információt folyamatosan használó enzimrendszerek működése során is keletkezhetnek hibák a DNS-ben, akár százezer számra, naponta. Ezeket ki kell javítani.

A hibajavításnak sok különböző formája van. A kémiailag legegyszerűbb esetben a hibás egységet, amely a DNS-ben egy nukleotid, valamely enzim helyreállítja. Sokszor azonban a hibajavítás ennél drámaian bonyolultabb: ekkor lépnek színre a DNS-helikázok. Vannak olyan szakaszai a javításnak, amikor két szálat szét kell választani, máskor pedig össze kell illeszteni. A legsúlyosabb következményekkel járó hiba a kettős száltörés, amikor a DNS mindkét szálán kémiai szakadás következik be. Sokszor a törés közvetlen szomszédságában levő régiók is károsodnak. Ekkor a hibás DNS-molekulával elvileg azonos információtartalmú, úgynevezett testvérkromatidról - egy másik DNS-szálról - be kell szerezni az információt az eredeti szálszakasz másolatának elkészítéséhez. Mondok egy analógiát: tegyük fel, hogy egy magnószalag elszakad és vissza is rojtosodik a két szalagvég, tehát egy információszakasz használhatatlanná roncsolódik. Ha van egy megegyező információtartalmú magnószalagunk, akkor lemásolhatjuk róla azt a darabot, amelyik egyenértékű információt tartalmaz a sérült résszel és a másolatot visszailleszthetjük a sérült helyre.

A RecQ családnak öt tagja van az emberben, azok közül is a Bloom-szindróma helikázt választottuk ki, mert ennek ismert a legtöbbféle mechanokémiai aktivitása a hibajavító mechanizmusokban. Ezeknek az aktivitásoknak a jelentős részét a jelenség szintjén azonosították, de a mechanizmus, a működés feltárása gyakorlatilag szűz területnek számít.

Néhány konferencián már megismerkedtem a „helikázos közösséggel”, és azt tapasztaltam, hogy a tudományos háttér és kultúra szempontjából más az összetétele, mint az „aktomiozinos és sejtvázmotoros társaságnak”. Az utóbbi kutatók elsősorban biokémiai, biofizikai orientáltságú csoportokban dolgoznak. Az ő vizsgálataik hosszabb múltra tekinthetnek vissza: 1953-ban javasolták a „csúszó filamentum”-modellt az izomműködésre (ugyanebben az évben jelent meg Watson és Crick cikke a DNS szerkezetéről), és ez már előzetes munkák hosszú során és komoly megfontolásokon nyugodott. A helikázokat elsősorban molekuláris biológusok, sejtbiológusok, genetikusok tanulmányozzák. Erre a területre a biofizika csak később csatlakozott be, mintegy „külső pályáról”. Ezért úgy érzem, rendkívül jó lehetőségeket kínál ez a kutatási terep. Továbbviszem az aktomiozinos kutatásokat, miközben a helikázos vizsgálatokat is szeretném kiszélesíteni, és az izgalmasabbnak bizonyuló kérdések felé tolódik majd el a hangsúly.

Úgy veszem észre, mostanában szétválasztják az úgynevezett „biológiát” és a biomolekulák működésének feltérképezését célzó „mechanizmusvizsgálatot”. Én mind a kettőt szigorúan biológiának tekintem. Azok a kollégák, akik sejtbiológiai, genetikai, élettani oldalról közelítik meg a működést, igyekeznek azonosítani az egyes élettani, genetikai folyamatokban részt vevő „játékosokat” - leggyakrabban a fehérjéket. Ezzel a törekvéssel rokon a rendszerbiológia, amelyről manapság méltán sokat hallunk. Ha a rendszer szintjén vizsgálódunk, akkor a mechanizmus tulajdonképpen a biológiai működés, és a modellbeli „atomok”, a tovább már nem osztott elemek - vagy ahogy a kollegák előtt mondom, a „krumplik”, amelyek szerkezete és működése már kiesik a kutatás fókuszából -, a fehérjék, makromolekulák. A fehérjék közötti kapcsolatokkal, kapcsolódásokkal foglalkozik általában a sejtbiológus, számára tehát a fehérje „krumpli”, és a kapcsolódás, sőt a működés leírása is nagyon sokszor igen-nem kérdések eldöntésén alapszik. Mondjuk, egy enzim az A szubsztrátot feldolgozza, a B-t nem, a K fehérjéhez kötődik, az L-hez nem, ezt a fehérjét az X fehérje aktiválja, az Y gátolja és így tovább. Ennek alapján fel tudunk rajzolni bizonyos rendszerábrákat, amelyeknek bináris jellege van. Az ilyen modellekkel jelentős mélységig el lehet jutni a sejtbeli folyamatok megismerésében. Ezért mind a mai napig rendkívül népszerűek és működnek is. Aki ezen a területen dolgozik, jogosan érzi, hogy a legfontosabb dologgal foglalkozik: ha létrejön egy rosszindulatú transzformáció a sejtben, a sejt rákossá válik, ő pedig azonosítja, hogy milyen elemek dolgoznak a folyamat irányában, milyenek ellene.

Úgy érzem, kezdünk a megértésnek arra a fokára érni, ahol egyre inkább szükségessé válik egy másik fajta tudás bekapcsolása. Ebben a megközelítésben nem bináris válaszokat keresünk, hanem számszerű, kvantitatív paramétereket, amelyek folytonos változók, és reményeink szerint majd le lehet velük írni és előre lehet jelezni a rendszer működését. Egyelőre néhány enzim, illetve enzimkomplex viselkedésének fizikai-kémiai leírása az a szint, amelyet érdemes megcéloznunk, és ebben a pályázatban éppen ezt tesszük. Biztos vagyok benne, hogy ezen a szinten is számos, előre nem látható jelenségre, tanulságra fogunk bukkanni. A működés komplexitását érzékeltetendő az enzimműködést elképzelhetjük valamely bonyolult cselekménysor analógiájára: az enzim kulccsal kinyitja a lakásajtót, hívja a liftet, lemegy vele, kilép az utcára, elsétál az újságoshoz, megveszi az újságot, elteszi a visszajárót, visszajön és odaadja az újságot - teszi mindezt úgy, hogy az események sora nem katonás rendben történik, végül az esetek nagy részében mégis hibamentes munkát végez.

De térjünk vissza a Bloom-helikázhoz. Ez a molekula sokféle DNS-struktúrához képes kapcsolódni, sok máshoz pedig nem. A viselkedését nem binárisan szeretném megvilágítani, hanem úgy, hogy a molekulának milyen affinitása, hajlama van a kötődéshez. Természetesen azoknak a folyamatoknak a kiindulási molekuláihoz, struktúráihoz kapcsolódik nagyobb hajlammal, amelyekben sejtbeli aktivitásai során működnie „kell”. Ezeken elvégez különböző mechanokémiai aktivitásokat, például - bizonyos hosszig, bizonyos sebességgel, bizonyos ATP-fogyasztás mellett - szétválasztja a DNS-szálakat; együttműködik más enzimekkel; aztán két homológ DNS-szálat még össze is illeszt. Azt igyekszünk kideríteni, hogyan teszi lehetővé az enzim szerkezete, hogy a molekula, szigorúan szabályozott módon, csak a „hasznos” aktivitásokat hajtsa végre. Ezt először a fehérje és a DNS kölcsönhatásának a szintjén próbáljuk megérteni. Ezután következik annak a legegyszerűbb aktivitásnak a vizsgálata, amelyet a motorenzimek kifejtenek: ez a DNS mentén egy irányban történő elmozdulás. Az egyenirányított mozgás minden aktivitás alapja. A helikáz felfogható egyszálú DNS-transzlokáznak, egyszálú DNS mentén mozgó enzimnek. Olyan erős a transzlokációs hajlama, hogy a másik DNS-szálat, amely ahhoz a DNS-szálhoz kapcsolódott, amelyen halad, „letúrja”, legöngyölíti maga előtt. Már meghatároztuk, milyen sebességgel halad a Bloom-enzim, milyen a processzivitása (hány lépést képes megtenni a DNS-en, mielőtt leesik róla), mennyi üzemanyagot, ATP-t fogyaszt egy távolságegység alatt.

Most kezdjük megismerni azt mechanizmust, amelyikkel az enzim szétválasztja a DNS két szálát. Két szélsőséges forgatókönyvet feltételezünk. Az egyik egy opportunista, passzív enzimmel számol, amelyik csak vándorol az egyszálú DNS mentén, és amikor kétszálú DNS-szakaszhoz ér, megvárja, amíg a termikus tánc, a hőmozgás a következő bázispárt szétválasztja, és beugrik a szálak közé - így halad tovább. A passzív szót nem szabad félreérteni: ne higgyük, hogy a folyamathoz nem szükséges üzemanyag. Az enzimnek folyamatosan váltogatnia kell az affinitását az egyszálú-kétszálú kapcsolat, illetve az egyszálú DNS között. Ha az affinitás nem változna ciklikusan (és ehhez energiafelvétel szükséges), az enzim stabilizálná a kapcsolatot és nem haladna tovább. Egy aktív enzim pedig - szélsőséges formában - megfogja és széthúzza a két szálat. A valóságot tükröző modell megalkotásához össze kell hasonlítanunk az egyszálú DNS-en haladó, illetve a kétszálú DNS-t szétválasztó enzimműködést. Az előzőről már sok részletet ismerünk, a következő félévben fogjuk vizsgálni a másodikat.

A Bloom-helikáz repertoárjában eggyel bonyolultabb aktivitás a szálvándoroltatás. Ehhez négy DNS-szálra van szükség: kettő kicserélődik a két kétszálú DNS-molekula között, s a folyamat közben a szálakat „arrébb kell vinni”. A Bloom-enzim szálpárosító aktivitását is tanulmányozni fogjuk.

A kétéves pályázati munka végén kvantitatív módon szeretnénk leírni a hibajavítás biológiai folyamatát, azonosítani a köztes állapotokat, feltárni az enzimmolekula egyes elemeinek szerepét a részfolyamatokban. Reményeink szerint az eredmények ötleteket adnak majd a folyamatok befolyásolásához is.

A helikázokat tanulmányozó közösségnek pedig az lehet a hosszú távú célja a következő egy-két évtizedben, hogy a mechanisztikus megközelítést összeegyeztesse a rendszerbiológiával, a sejtbeli hálózatok vizsgálatával. Ez egyáltalán nem könnyű, hiszen nagyon sok komponenssel kell számolni, a hálózatok bonyolultak. A rendszerbiológus a hálózatot térképezi fel, és néhány száz, néhány ezer résztvevő között azonosítja a kapcsolatokat. Mi a néhány ezer résztvevő közül három-négy-öt fontosnak tartott fehérje kapcsolatairól szerzünk részletesebb információt. Természetesen az összes kapcsolatot gyakorlatilag lehetetlen részletesen megismerni - ki kell majd találnunk a különböző tudások egyesítésének módját is.

Hogyan követik nyomon az enzim működését?

Elsősorban optikai jeleket vizsgálunk: a fényelnyelést és a gerjesztő fénnyel való besugárzás utáni fénykibocsátást, a fluoreszcenciát. Az enzimben vannak olyan természetes aminosavak, elsősorban a triptofán, amelyek fluoreszcens sajátságokkal rendelkeznek, és amikor az enzim szerkezete megváltozik, más lesz például a fénykibocsátás intenzitása.

A leggyakrabban stopped-flow, megállított áramlású berendezést használunk: ez egy fluoreszcencia-jeleket mérő műszer, gyors keverőrendszerrel összekapcsolva. A kézi keverés csak másodperces felbontást engedélyez. A másodpercnél gyorsabban bekövetkező folyamatokat nem így kell vizsgálni. Egy motoros gépezet különböző fecskendők tartalmát milliszekundumok vagy még rövidebb idő alatt összekeveri, utána pedig nyomon követjük a reakciók lefolyását. Szerencsére a vizsgált reakciók többnyire ezen az időskálán zajlanak.

Más csoportokkal is együttműködünk, az ő eredményeikre is támaszkodunk. Röntgenkrisztallográfiával atomi szinten határozzák meg egyes fehérjék szerkezetét. Elektronmikroszkópiával, illetve atomerő-mikroszkópiával - nagyobb skálán, kisebb felbontásban - bonyolultabb komplexek szerkezetét lehet feltárni, például DNS-enzim együtteseket vizualizálhatunk.

A szerkezetek időbeli változása is letapogatható így?

A kutatás frontvonalához tartozik, hogy a szerkezetvizsgáló módszereket is alkalmassá tegyék az időtől függő folyamatok követésére. Mondok egy példát: a mikroszkópos vizsgálatokhoz az összekevert anyagokból bizonyos idő elteltével mintákat veszünk. Angliában egy kolléga most a gyors keveréses rendszert ötvözi az elektronmikroszkóppal, és a komponensek összekeverése után néhány milliszekundumon belül már felvételt tud készíteni.

A képsorozatainkon azért mi is rekonstruálni tudjuk az eseményeket. Persze, nem egy DNS-szálon futó enzimet látunk, hanem a különböző alakzatok részarányát tudjuk elemezni. Tegyük fel például, hogy egy enzim hosszúkás formából hajlottba megy át, és ezt a változást egy kis molekula kötődése indítja el. Összekeverjük az enzimet a kis molekulával, rövid ideig hagyjuk őket reagálni, és utána fixáljuk a mintát a mikroszkópos lemezen. A különböző időtartamokig felvett reakciók esetében az egyenes és a hajlított molekulák aránya folyamatosan változik, és a hajlottaké az idő előrehaladtával egyre nagyobb.

A molekuláris motorok vizsgálatában nagyon fontosak az egyedi molekulák mechanika- és fluoreszcencia-vizsgálatai. Négy éve jöttem haza az Egyesült Államokból, azóta több kollégával együtt kiépítettük a mostani műszerparkot. Egyedi kutatási támogatásokból nem tudjuk megvenni a műszereket, de több pályázatból már igen. A következő években szeretnénk elérni, hogy a reakciók lefolyását az egyedi molekulák szintjén vizsgálhassuk. Például mikrométer nagyságú gömbök mozgását tudjuk majd kontrollálni a tanulmányozott rendszerben optikai úton, lézerfénnyel, vagy mágneses erőtérrel. Pikonewton, 10-12 newton nagyságú erőt fejthetünk ki; az enzimmolekulák körülbelül ekkora erővel hatnak a szubsztrátjukra.

Hogyan zajlik egy kísérlet?

Kihúzunk, mondjuk, egy DNS-molekulát a tárgylemez-aljzat és a gyöngy között, majd a gyöngyre állandó erőt gyakorolunk, rendszerint mágneses erőtérrel. Az egy- és kétszálú DNS mechanikai tulajdonságai eltérőek. Ha enzim kötődik a részlegesen kétszálú molekulához, amelynek van egyszálú DNS-szakasza, akkor a kettős szál szétválasztása közben megváltozik a DNS rugóállandója - keménysége -, és erre a gömb mozgásából lehet következtetni.

Hányan dolgoznak együtt a csoportban?

Amikor hazajöttem, sok mindent kellett gyorsan megtanulnom - még azt is, hogy milyen csoportstruktúrát érdemes kialakítani. Először nem volt elég munkatársam, utána pedig sok időt kellett szánni a kevesebb tapasztalattal rendelkező kollégák betanítására. Ez szinte a teljes időmet elvitte. Az utóbbi egy-másfél évben már jól működik a „tudásmenedzsment”, a csoport tagjai hatékonyan tudják megosztani a tudásukat. Gyimesi Máté, aki a tanszéken készítette el a PhD-disszertációját, már önállóan dolgozik: ideje nagy részét a Bloom-helikázos projektekre fordítja. Négy PhD-hallgatóm közül háromnak mostanra sokéves kutatási tapasztalata gyűlt össze. Hamarosan elkészül a disszertációjuk, és remélem, sikerül jó laboratóriumban elhelyezni őket a nagyvilágban.